Abstract
P 069
Hocheffiziente nicht-virale Transfektion primärer Pigmentepithelzellen
Sandra Johnen, Christiane Maltusch, Gabriele Thumann
RWTH Aachen, Universitäts-Augenklinik, IZKF Biomat., Aachen
Hintergrund
Vorangegangene Studien haben gezeigt, dass (a) in Suspension transplantierte autologe Pigmentepithelzellen zwar gut vertragen werden, jedoch keine signifikante funktionelle Verbesserung zur Folge haben und (b) in Tiermodellen mit retinaler Degeneration eine Reihe von Wachstumsfaktoren die Degeneration von Photorezeptorzellen verhindern bzw. verzögern. Aus diesem Grund stellt der Ersatz degenerierter RPE Zellen sowie die Bereitstellung eines oder mehrerer neurotropher Faktoren, die mittels Transplantation von Monolayern aus genetisch modifizierten Pigmentepithelzellen in den subretinalen Raum eingebracht werden, eine vielversprechende Möglichkeit zur Behandlung der AMD dar. Der Einsatz viraler Vektoren wird durch die mögliche Ausbreitung des Virus sowie ernsthafte Immunreaktionen erschwert. Wir haben daher die Methode der nicht-viralen Transfektion untersucht, um das für PEDF (Pigment Epithelium-Derived Factor) kodierende Gen in Pigmentepithelzellen einzubringen.
Methode
Primäre Pigmentepithelzellen wurden durch Elektroporation mit Plasmiden, die rekombinantes PEDF und PEDF-EGFP Fusionsproteine kodieren, transfiziert. Die PEDF Fusionsproteine, die von den Zellen exprimiert und ins Zellkulturmedium sezerniert werden, wurden mit Hilfe der Ni-NTA Metallaffinitätschromatographie aufgereinigt und durch Immunoblots nachgewiesen. Des Weiteren wurde die Hochregulation der mRNA Expression des Zinktransporterproteins ZIP2 in kultivierten ARPE-19 Zellen untersucht, um die biologische Aktivität der PEDF Fusionsproteine nachzuweisen.
Ergebnisse
Primäre Pigmentepithelzellen wurden erfolgreich mit Effizienzen größer als 70% transfiziert. Die PEDF Fusionsproteine, die von den Zellen exprimiert und ins Zellkulturmedium sezerniert werden, konnten über einen Zeitraum von vier Monaten bzw. fünf Passagen nachgewiesen werden. Die PEDF Fusionsproteine waren biologisch aktiv, was durch die Hochregulation der ZIP2 mRNA Expression in ARPE-19 Zellen nachgewiesen wurde.
Schlussfolgerungen
Mittels Elektroporation ist es möglich, primäre Pigmentepithelzellen auf nicht-viralem Weg mit hoher Effizienz zu transfizieren. Wir konnten zeigen, dass Pigmentepithelzellen, die mit dem für PEDF kodierenden Gen transfiziert wurden, biologisch aktives PEDF über einen langen Zeitraum exprimieren und sezernieren. Der Nachweis nach 5 Passagen lässt darauf schließen, dass das transfizierte PEDF Gen ins Genom der Zelle integriert ist.
Seitenanfang