Abstract

P 149

Der lösliche VEGF-Rezeptor 1 ist ein bedeutender antiangiogenischer Faktor der Amnionmembran

Mikk Pauklin, Henning  Thomasen, Klaus-Peter Steuhl, Daniel Meller
Zentrum für Augenheilkunde, Universitätsklinikum Essen, Essen

Hintergrund
Amnionmembran (AM) wird aufgrund ihrer antiangiogenischen, antiinflammatorischen und wundheilungsfördernden Eigenschaften seit Jahren in der Ophthalmochirurgie eingesetzt. Der bedeutende angiogenische Faktor, VEGF (vascular endothelial growth factor), wird in verschiedenen Geweben von einer löslichen Splice-Variante seines Rezeptors (sFLT-1) neutralisiert. Ziel dieser Studie war es zu untersuchen, ob sFLT-1 in AM exprimiert wird und ob es zu den antiangiogenetischen Eigenschaften des Gewebes beiträgt.
Methode
Aus Proben von sechs verschiedenen AM, zentraler Kornea, kornealem Epithel und auf kryokonservierter AM kultivierten limbalen epithelialen Zellen (HLEC) wurden RNA und Proteine isoliert und die Expression von sFLT-1 mittels Real-Time PCR und Western Blotting untersucht. Die AM Proben wurden kryokonserviert und für drei Monate bei -80°C gelagert. Dieses Gewebe wurde zur Herstellung von konditioniertem Medium (CM) bei 37°C in Kulturmedium (0,5ml/cm2) inkubiert. Das Medium wurde entweder nach 1, 2, 3, 5, 7, 9, 12 und 14 Tagen gewechselt oder nach insgesamt 3 Tagen. Die von der AM in diesem Zeitraum abgegebene Menge sFLT-1 wurde mittels ELISA gemessen. Das mit jeder AM Probe für drei Tage konditionierte Medium wurde entweder mit einem sFLT-1 neutralisierenden Antikörper oder einer Isotyp-Kontrolle versetzt. Um den Effekt von CM und sFLT-1 auf die Angiogenese zu untersuchen wurden HUVEC (Human umbilical vein endothelial cells) für drei Tage in 20, 40, 60, 80 und 100%igen CM kultiviert und ihre Proliferation mittels eines MTT Assays analysiert.
Ergebnisse
Die Expression von sFLT-1 in AM war 5-fach höher als in der Kornea, mehr als 170-fach höher als in kornealem Epithel und 1000-fach höher als in HLECs. Nach einem Tag wurden 0,3 ng/cm2 sFLT-1 von der AM freigesetzt, während des folgenden Tages 0,04 ng/cm2, an den darauffolgenden Tagen wurden keine detektierbaren Mengen entlassen. Das CM zeigte einen konzentrationsabhängigen hemmenden Effekt auf die Proliferation von HUVEC. Unverdünntes CM verursachte eine Inhibition von 33%. Der inhibierende Effekt konnte durch die Zugabe eines spezifischen sFLT-1 Antikörpers deutlich neutralisiert werden.
Schlussfolgerungen
Die Expression von sFLT-1 ist in AM signifikant höher als in der Kornea, kornealem Epithel oder HLECs. sFLT-1 wird während der ersten Tage des Gebrauchs von der AM freigesetzt und ist möglicherweise einer der Schlüsselfaktoren für ihre antiangiogenischen Eigenschaften.

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