Abstract

DO.14.06

Ophthalmologische Gewebespenden – Änderungen und Effekte am Beispiel der Mitteldeutschen Corneabank Halle

Diana Wille1, Timm Bredehorn-Mayr2, Gernot Duncker2
1Deutsche Gesellschaft für Gewebetransplantation, Hannover, 2Universitätsklinik und Poliklinik für Augenheilkunde, Martin-Luther-Universität Halle-Wittenberg, Halle/Saale

Hintergrund
Die Transplantation kultivierter limbaler Epithelien gilt als erfolgreiche Therapie bei Limbusstammzellinsuffizienzen. Bislang existiert jedoch keine systematische Studie bzgl. optimaler Kulturbedingungen zur Erhaltung von Epithel-/Stammzelleigenschaften. Ziel ist das Studium des Wachstumsverhaltens ex vivo kultivierter oraler und kornealer Epithelzellen auf Amnionmembran (hAM) mit und ohne Ko-Kultivierung verschiedener feeder layer und Vergleich der Zellcharakteristika unter verschiedenen Kulturbedingungen.
Methode
Orale und limbale Epithelialzellen wurden mittels Mikrodissektion isoliert und  und nach Behandlung mit Dispase und Trypsin/EDTA auf intakter hAM im Transwell-Verfahren kultiviert. Die Zellen wurden mit (1) murinen 3T3 Fibroblasten, (2) humanen dermalen Fibroblasten, (3) humanen Knochenmarksfibroblasten, und (4) ohne feeder layer, für drei Wochen, ko-kultiviert. Der Zellverband wurde mittels Immunfluoreszenz auf die Expression epithelialer und Stammzellmarker untersucht. Zudem wurden colony forming assays der kultivierten Epithelien zur Beurteilung der Stammzelleigenschaften der Kulturen durchgeführt.
Ergebnisse
Unter allen Kulturbedingungen bildeten korneale und orale Zellen ein stratifiziertes Epithel, ohne wesentliche morphologische Unterschiede. Anhand immunhistochemischer Färbungen konnte Zytokeratin-3, Zytokeratin-4 und Connexin 43 nachgewiesen werden, Differenzierungsmarker für korneales Epithel. Integrin-ß1, ein putativer Stammzellmarker, konnte in allen Epithelzellen detektiert werden, auch in jenen kultiviert ohne feeder layer. Ko-Kultivierung limbaler Epithelien mit 3T3 Zellen führte zur höchsten Expression der untersuchten Marker. Orale Mukosaepithelien jedoch zeigten in Ko-Kultivierung mit Knochenmarks- und dermalen Fibroblasten die höchste Expression der untersuchten Antikörper. Die colony forming Effizienz oraler Epithelien ko-kultiviert mit Knochenmarksfibroblasten betrug bis zu 9%.
Schlussfolgerungen
Es gelang die erfolgreiche Kultivierung stratifizierter Epithelverbände oraler und limbaler Epithelien, die putative Stammzell- und korneale Epithelmarker exprimierten, auf hAM unter Verwendung von feeder layern humanen Ursprungs. Interessanterweise waren unsere Kulturbedingungen förderlich für epitheliales Zellwachstum und -differenzierung, selbst ohne Verwendung einer feeder layer. Weitere Experimente sind noetig zur Beurteilung der Verwendbarkeit dieser Zellkonstrukte vor einer Transplantation am menschlichen Auge.

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