Abstract

DO.19.08

Darstellung von Lysosomen des retinalen Pigmentepithels durch strukturierte Beleuchtung

Thomas Ach1, Gerrit Best2, Mira Ruppenstein1, Roman Amberger2, Cristoph Cremer2, Stefan Dithmar1
1Universitäts-Augenklinik Heidelberg, 2Kirchhoff-Institut für Physik, Universität Heidelberg

Hintergrund

Lipofuszin als Hauptgruppe der Fluorophore des Fundus erlaubt bei Autofluoreszenzaufnahmen Rückschlüsse auf die metabolische Aktivität des retinalen Pigmentepithels (RPE). Weitfeld- und Zwei-Photonen-Aufnahmen des RPE ermöglichen derzeit eine Auflösung von etwa 300 bis 400nm. Erstmals wird hier die Anwendung der strukturierten Beleuchtung mit einer verbesserten Auflösung zur Darstellung von fluoreszierendem Material des RPE vorgestellt.

Methode

Durch strukturierte Beleuchtung lässt sich die Auflösung eines Weitfeldmikroskops bis zum Faktor zwei erhöhen. Damit werden, je nach Anregungswellenlänge und verwendetem Objektiv, laterale Auflösungen von etwa 100 bis 150 nm erreicht. In axialer Richtung kann die Auflösung ebenfalls verbessert werden (3-Strahl Interferenz), wodurch sich aufgrund des erweiterten Frequenzbereichs die Lücke in der optischen Transferfunktion („missing cone“) auffüllen lässt, wodurch sich eine bessere Tiefenseparation ergibt.
Das RPE entparaffinierter Retinaschnitte (Alter der Retina: 2 bis 89 Jahre) wurden mit dieser Technik nach Anregung mit Laserlicht unterschiedlicher Wellenlänge (404 nm bis 647 nm) bezüglich ihrer Fluoreszenzeigenschaften beurteilt.

Ergebnisse

Intrazelluläre Strukturen des RPE lassen sich mit einer lateralen Auflösung von 150 nm darstellen. Mit zunehmendem Alter der Retina erhöht sich der Anteil von fluoreszierendem Material (FM) in den Lysosomen. Während sich in der Retina jüngeren Alters das FM im Gesamtbild inhomogen erweist (durch unterschiedliche Wellenlängen lassen sich unterschiedliche fluoreszierende Strukturen anregen), zeigen ältere Netzhäute homogenere großflächige Bereiche (unterschiedliche Wellenlängen regen meist gleiche Strukturen an). Die Betrachtung einzelner Lysosomen zeigt jedoch ein inverses Bild. Im höheren Alter zeigen einzelne Lysosomen eine strukturell inhomogenere Zusammensetzung im Vergleich zu jüngeren Netzhautschnitten.

Schlussfolgerungen

Mit der hier gezeigten strukturierten Beleuchtung können erstmals fluoreszierende mikroskopische Strukturen des retinalen Pigmentepithels in einer lateralen Auflösung von 150 nm dargestellt werden. Damit können die altersabhängige Verteilung und Veränderung des fluoreszierenden Materials in den einzelnen Lysosomen als auch wellenlängenabhängige intralysosomale Verteilungsmuster der Lipofuszin-Fluorophore sichtbar gemacht werden und lassen neue Einblicke in die Pathogenese des RPE zu.

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